呕吐毒素对断奶仔猪生长性能、免疫和肠道微生物的影响及益康脱毒效果评估
时间：2020-05-19 点击：2230
孙铝辉1，刘强2，Niel Karrow3
1、华中农业大学 教授，2、江苏奥迈生物科技有限公司 研发总监，3、加拿大圭尔夫大学 教授
为方便您的阅读，已将英文译成中文版，内容如下：
（原文已附于本文末尾）
1 背景
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素，DON），主要由镰刀菌属产生的真菌毒素，是全世界谷物作物中最常见的霉菌毒素之一（Schothorst 等，2004）。研究报道人和家畜摄入含有呕吐毒素污染的食品或饲料后会导致其拒食、呕吐、免疫力下降和肠道疾病的发生（Sobrova 等，2010）。所有的动物中，猪对呕吐毒素非常敏感（Rotter 等，1996），由于猪饲料中玉米和小麦的比例很高，所以呕吐毒素对其危害的风险更大。呕吐毒素在小肠上部，尤其是回肠，被快速有效的被吸收（Etienne 等，2008）。如果动物摄入足够高浓度的呕吐毒素，则会引起炎症反应，从而损害粘膜上皮细胞屏障，并可导致营养物质的吸收，以及构成肠道内条件致病性微生物的生长（Pestkaand Smolinski, 2005；Bouhetand Oswald, 2005；Park 等，2017）。
猪肠道健康取决于肠道菌群的多样性和稳定性（Hopwood 等，2002），而真菌毒素会导致肠道微生物菌群生态失调（Robert 等，2017），特别是在断奶时期，因为此时仔猪饮食突然变化引起的肠道菌群失调是导致断奶仔猪腹泻的主要原因（Gresse 等，2017）。虽然肠道微生物群失调与 DON 诱导的厌食相关（Peng 等， 2017），但很少有研究探究了 DON 对肠道微生物群落的直接影响，报告结果也不一致。例如，仔猪饲喂 DON 污染的饲料，发现其粪便中好氧嗜温菌数量减少， 同时，日增重和采食量的降低（Wache 等，2009）。相反，另一个研究显示，大鼠口服 DON 后，其肠道内大多数微生物没有发生明显变化（Saint-Cyr 等，2013）。 DON 诱导的肠道损伤和肠道微生物菌群稳态的关系尚不清楚，需要进一步研究。由于 Illumina-MiSeq 高通量测序技术最近已被应用于人类和实验动物肠道微生物研究（David 等，2014; Yang 等，2017），利用该技术研究肠道微生物群菌群多样性的变化可有助于我们更好地了解 DON 对仔猪肠道健康的影响。
除了胃肠道损伤外，免疫系统也是 DON 毒性的主要靶标（Pestka 等，2004）。据报道，摄入 DON 污染的饲料可影响不同物种的免疫应答，包括啮齿类动物、人类、禽类和猪（Barbara 等，1996）。例如，前人研究报道断奶仔猪采食 DON污染的饲料（2.5mg DON/kg）后能显著增加其卵白蛋白（OVA）-特异性免疫球蛋白 IgA 的含量（Pinton 等，2008）。由于 IgA 是粘膜表面的主要免疫球蛋白，这可能与反馈性增加对肠道病原体的抵抗有关（Li 等，2005）。由于用新型抗原（如 OVA）免疫刺激机体，检测机体的免疫应答反应是评估免疫系统对商业疫苗和病原体攻击反应状况的有效的间接方法，该方法能有效用于评价DON 诱导的免疫应激对动物健康的影响（Pestka 等，2003）。
2 研究目的
研究 DON 对断奶仔猪生长性能、免疫和肠道微生物菌群的影响及AmdetoxTM 脱毒剂脱毒效果评估。
3 实验设计
3.1 仔猪、饲料和试验设计
本试验选取 28 头断奶仔猪（3 周龄），随机分配到 4 个处理组，每组 7 头，每头仔猪饲养于 1 个代谢笼。第 1 组饲喂基础（BD），其日粮满足 NRC（2012）的营养需要量，其它 3 组饲喂 BD 分别添加 1.0 mg/kg DON、3.0 mg/kg DON 及3.0 mg / kg DON + 0.05％Amdetox（AmdetoxTM 脱毒剂为江苏奥迈产品）。在饲养试验的第 1 和 2 周末时接种 OVA（加佐剂 Quil A）、伪狂犬疫苗、猪瘟疫苗、猪圆环病毒疫苗（注意：接种剂量为商业用量的一半）。在试验的第 2、3 和 4 周末时采血。此外，在试验的第 3 及 4 周末时用OVA 做皮试，检测第 0、3、6 及 24h 的皮试反应。试验结束后（第 4 周末），屠宰仔猪采集血液、肠道（十二指肠、空场及回肠）及肠道微生物样本用于后续分析。
3.2 检测指标
生长性能：记录试验期间仔猪每周的体重及采食量，计算其日增重和饲料转化率。
血清生化：采集仔猪试验期第 2、3 和 4 周时的血液，测定 LPS 的浓度及OVA、伪狂犬病、猪瘟的血清抗体滴度。
肠道抗氧化指标：通过比色法测定肠道样品中 SOD、及 T-AOC 活性以及GSH 。
组织学评估：十二指肠、空肠和回肠组织病理变化。
肠道微生物分析：用 Illumina-MiSeq 高通量测序技术将检测猪的肠道（十二指肠、空肠和回肠）微生物菌群变化。
3.3 统计分析
使用SPSS 13 版（Chicago，IL，USA）进行统计分析。数据以平均值±标准误形式表示。数据将通过 Tukey-kramer 方法进行多重比较，组间差异 P < 0.05 表示差异显著。
4 试验结果及分析
4.1 日粮中各毒素含量
4.2 生长性能指标
由表 3 可知，与对照组相比，日粮添加 DON 为 1.0 mg/kg 能显著降低（P < 0.05）仔猪在 1-2 周、3-4 周及 1-4 周的体增重（16.0-60.8%）和（或）采食量（18.1-38.7%）及显著增加（P < 0.05）1-4 周的料肉比（12.8%）。与日粮添加1.0mg/kgDON 组相比，日粮添加 3.0mg/kg DON 能进一步降低（P < 0.05）仔猪3-4 周体增重（21.2%）和采食量（21.7%）。值得注意的是，日粮中添加 0.05%的 Amdetox 脱毒剂能有效的缓解 3.0mg/kg DON 对仔猪在 1-2 周、3-4 周及 1-4 周的体增重、采食量和（或）料肉比的危害。
4.3 血清生化指标及抗体滴度
由表 4 可知，与对照组相比，尽管日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 对DAO无显著（P > 0.05）影响，但其能显著增加（P < 0.05）仔猪血清 LPS 的含量（46.2-51.4%）。值得注意的是，日粮添加 0.05%的 Amdetox 脱毒剂能有效的抑制（P < 0.05）DON 至仔猪血清LPS 浓度的上升。
注：结果表示为平均数±标准误（n=7），同行肩标不同小写字母表示差异显著（P ＜0.05）。 Arbitrary unit, 相同度量条件下各数据间的相对大小值。
由表 5 可知，与对照组相比，日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 对可降低（P < 0.05）仔猪第四周血清中圆环抗体滴度（33.1-40.1%），而日粮添加 0.05%的 Amdetox 脱毒剂能有效的缓解DON 对猪血清圆环抗体滴度的影响。此外，日粮添加 DON 及 0.05%的 Amdetox 脱毒剂对仔猪血清中狂犬抗体滴度、瘟抗体滴度及OVA 抗体滴度无显著（P > 0.05）影响。
4.4 肠道抗氧化指标
由表 6 可知，与对照组相比，日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 对十二指肠、空肠及回肠 T-AOC 无显著（P > 0.05）影响，而日粮添加 0.05%的Amdetox脱毒剂能增加（P < 0.05）空肠 T-AOC 。此外，日粮添加 DON 及Amdetox 脱毒剂能提升十二指肠、空肠及回肠 SOD 和（或） GSH 含量（此结果与预期相反，可能是反馈性调控）。
4.5 肠道组织学变化
由图 1A 可知，和对照组相比，日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠绒毛上皮细胞坏死脱落，绒毛断裂脱落。固有层水肿，炎性细胞增多。由图 1B 可知，日粮添加 1.0 mg 及 3.0 mg/kg DON 使得仔猪空肠出现轻微肠绒毛上皮变性坏死。由图 1C 可知，和对照组相比，日粮添加1.0 mg 及 3.0 mg/kg DON 使得仔猪回肠淋巴细胞增生，肠绒毛上皮细胞变性坏死脱落，固有层水肿。值得注意的是，日粮添加 0.05%的Amdetox 脱毒剂组中十二指肠、空肠及回肠未见明显病理变化（图 1A-C）。
图 1 （A）十二指肠、（B）空肠及（C）回肠组织形态学变化
4.6 肠道微生物变化
4.6.1 肠道 Alpha 多样性变化
48 个肠道内容物样品（三个肠段：十二指肠、空肠、回肠）总共得到 1915624 条序列。平均序列量 39908 条，每个序列平均长度 421bp。不同处理组仔猪内容物微生物在97%相似性阈值上多样性指数见表 7。
与对照组相比，日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠、空肠及回肠 chao1 指数显著升高，表明日粮添加 DON 增加了仔猪小肠菌群丰度，而日粮 0.05%的 Amdetox 脱毒剂组中未影响十二指肠中的chao1 指数。此外，日粮中添加DON 及 0.05%的 Amdetox 脱毒剂对仔猪十二指肠、空肠及回肠 Shannon 指数无显著影响，表明其对仔猪小肠菌群多样性无显著影响。
4.6.2 肠道分类学组成变化
日粮添加 DON 对仔猪小肠微生物在门水平优势菌群影响见图 2。在门水平上，仔猪十二指肠、空肠及回肠的优势菌群均为放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。与对照组相比，日粮添加 1.0 和（或）3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠、空肠及回肠中蓝藻门相对丰度上升，而变形菌门和厚壁菌门相对丰度下降；日粮添加1.0 和 3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠及回肠中放线菌门相对丰度上升，而使得空肠中放线菌门相对丰度下降。此外，日粮中添加 DON 及 0.05%的 Amdetox 脱毒剂使得 DON 导致小肠菌群紊乱得到一定的改善。
图 2（A）十二指肠、（B）空肠及（C）回肠门水平优势菌群相对丰度
日粮添加 DON 对仔猪小肠微生物在属水平优势菌群影响见图 3。在属水平上，仔猪十二指肠、空肠及回肠的优势菌群均为乳酸杆菌（Lactobacillus）、贪铜菌（Cupriavidus）、不动杆菌（Acinetobacter）、伯克氏菌（Burkholderia）、葡萄球菌（Staphylococcus）、苍白杆菌（Ochrobactrum）、棒状杆菌（Corynebacterium）及链球菌（Streptococcus）。与对照组相比，日粮添加 1.0 和 3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠、空肠及回肠中总的优势菌群下降。其中，与对照组相比，日粮添加 1.0 和（或）3.0 mg/kg DON 使乳酸杆菌和贪铜菌的丰度降低，而使得葡萄球菌的丰度上升。然而，日粮添加 1.0 和 3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠及空肠中伯克氏菌相对丰度下降，而使得回肠中伯克氏菌相对丰度上升。此外，日粮中添加 DON 及 0.05%的 Amdetox 脱毒剂能改善 DON 导致的小肠菌群紊乱。
图 3（A）十二指肠、（B）空肠及（C）回肠属水平优势菌群相对丰度
5 试验总结
由本试验可得出以下主要结论：
（1） 日粮添加 1.0 和 3mg/kg DON 能显著降低仔猪在 1-2 周、3-4 周及 1-4 周的体增重、采食量和（或）料肉比，而日粮中添加 0.05%Amdetox 脱毒剂能有效缓解 DON 至仔猪生产性能的危害。
（2） 日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 能降低仔猪第四周血清中圆环抗体滴度、增加血清 LPS 的含量。同时，病理切片结果显示，日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 使得仔猪十二指肠、空肠及回肠绒毛上皮细胞坏死脱落、绒毛断裂脱落、固有层水肿及炎性细胞增多。此外，这边变化与其损伤肠道抗氧化平衡有关。而日粮中添加 0.05%Amdetox 脱毒剂能有效缓解 DON 至仔猪血清免疫指标及肠道健康的损伤。
（3） 日粮添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 能提高了断奶仔猪小肠肠道微生物的丰富度。其中，日粮添加 1.0 和（或）3.0 mg/kg DON 使得仔猪小肠肠道乳酸杆菌和贪铜菌的丰度降低，而使得葡萄球菌的丰度上升。此外，日粮中添加 DON及 0.05%的Amdetox 脱毒剂能有效缓解DON 导致的仔猪小肠菌群紊乱。
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