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丁酸梭菌的分离鉴定及益生特性

    丁酸梭菌菌落为灰白色，中间隆起呈煎蛋样，菌体单个生或对生，呈直杆状或者稍微弯曲的短链结构，周边具有运动性的鞭毛。丁酸梭菌最适 pH值为4.0～9.8，最适温度为25～37 ℃。另外，丁酸梭菌在室外具有良好的稳定性，对多种抗生素都具有很强的耐药性，但是对少数新生霉素、四环素、万古霉素等比较敏感。丁酸梭菌能分泌淀粉酶和发酵多种糖类产酸。根据《伯杰细菌鉴定手册》，丁酸梭状芽孢杆菌为严格厌氧菌，菌株在培养过程中可产酸产气，内生孢子为卵圆形到球形，偏心或次端生。

图1 菌落形态及革兰氏染色显微镜下观察照片

2.1 主要培养基：

    梭菌选择培养基（TSN培养基），用于丁酸梭菌的分离培养，其配方为：胰蛋白胨17  g/L、大豆蛋白胨3 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L和葡萄糖2.5 g/L；

    梭菌增殖培养基（RCM培养基），用于丁酸梭菌的纯培养，其配方为：酵母浸粉3g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、可溶性淀粉1 g/L、葡萄糖5 g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、氯化钠3 g/L和乙酸钠3 g/L；

          LB培养基由胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L和氯化钠10 g/L组成；

    普通肉汤培养基由蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L和氯化钠5 g/L组成。

    上述各培养基分别加入2%琼脂即可配成固体培养基。

2.2  分离鉴定

   （1）无菌称取样品放入无菌生理盐水中溶解；

   （2）用生理盐水进行10倍梯度稀释；

   （3）分别稀释涂布于TSN培养基中置于37℃恒温培养箱中静置厌氧培养48ｈ，观察菌落形态特征。

   （4）对可疑菌落进行革兰氏染色，用显微镜油镜观察不同菌落的菌体特征和染色特性。

   （5）选取符合丁酸梭菌形态特征的菌落划线接种ＲＣＭ培养基继续培养，直到得到可疑菌落的纯培养物。

   （6）进行生理生化检测以及16SrDNA鉴定

    生理生化参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对可疑菌落的纯培养物进行生理生化鉴定。鉴定项目包括硝酸盐还原、明胶液化、吲哚、硫化氢产生以及蜜二糖、松三糖和淀粉的发酵。

    鉴定结果：对该分离株进行硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解、糖发酵等试验，其鉴定结果如表1。从生化反应结果来看，该菌株的特征与丁酸梭菌是一致的，初步鉴定该分离株为丁酸梭菌。

提取丁酸梭菌分离株的基因组，以其为模板进行1616SrDNA的PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后结果见图2，可见一条大小为1500 bp左右的特异性条带，与预期条带大小相符。将目的条带进行胶回收纯化和核苷酸测序，并将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，结果表明，该菌株的1616SrDNA基因序列与丁酸梭菌（NCBI登录号：KC196777.1）同源性达100％，因此确定该分离株为梭菌属丁酸梭菌。

3.1 丁酸梭菌的抑制致病菌能力

    丁酸梭菌培养上清液抑制致病菌能力的结果见表2和表3。其中表2为牛津杯法测定的试结果，对照组是RCM培养液，其抑菌圈直径为0mm，对致病菌无抑制作用，而丁酸梭菌培养上清液作用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌后，抑菌圈直径分别为25.0、26.3、28.4mm。由此可知，丁酸梭菌培养上清对这３种致病菌均有良好的抑制作用，其中对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用最强。

活菌计数法试验结果见表３。丁酸梭菌培养上清液作用大肠杆菌5、15、30、60min后抑菌力分别提高了53.33％、56.67％、68.33％、78.33％；丁酸梭菌培养上清液作用猪霍乱沙门氏菌5、15、30、60min后抑菌力分别提高了56.67％、60.33％/69.67％、78.67％；丁酸梭菌培养上清液作用鼠伤寒沙门氏菌5、15、30、60min后抑菌力分别提高了59.67％、61.33％、70.33％、83.33％，并且随着丁酸梭菌培养上清液作用时间的延长对这３种致病菌的抑制作用均有所增强。由此可见，牛津杯法和活菌计数法测定丁酸梭菌抑菌能力的试验结果是一致的。试验数据表明，丁酸梭菌能够有效抑制3种致病菌的生长，抑制作用由强到弱依次为鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和大肠杆菌。

3.2 丁酸梭菌对IPEC-J2（猪小肠上皮细胞）生长的影响

    用不同剂量的丁酸梭菌处理IPEC-J2细胞3h，显微镜下观察细胞生长状况，当MOI（MOI＝细菌数量/细胞数 量）为0、1、10和50时细胞生长状况均良好，表现为细胞透明度大、折光性强、轮廓不清，当MOI为100时，细胞折光性降低、轮廓增强、细胞之间空隙增大、细胞形态不规则，少量细胞甚至死亡，漂浮在细胞培养液中。由此可见，MOI为1、10和50时丁酸梭菌对细胞的正常生长无可见影响，当MOI为100时，丁酸梭菌会影响细胞的正常生长，造成细胞损伤甚至死亡。

3.3 丁酸梭菌黏附IPEC-J2的能力 

由表4可知，与丁酸梭菌作用细胞3h相比，丁酸梭菌作用细胞6、12h，其黏附指数分别增加4.9%、4.0%，丁酸梭菌作用24h时，黏附指数降低了1.8%，无显著差异（p＞0.05），其中作用时长为6h时丁酸梭菌黏附细胞的数量最多，说明丁酸梭菌对猪肠上皮细胞具有很好的黏附性。

由表5可知，与MOI为1相比，MOI为10、50、100时，丁酸核菌的黏附能力均显著增加（Ｐ＜0.05），且以MOI为50时丁酸梭菌的黏附能力最强。显微观察发现，MOI为100时，较多的细胞形态发生了改变，并伴有部分细胞漂浮于培养液中，因此，丁酸梭菌处理浓度MOI为100时对细胞具有损伤作用。

3.3丁酸梭菌对致病菌黏附IPEC-J2的影响

    由表6可知，与大肠杆菌刺激细胞0ｈ相比，大肠杆菌刺激细胞3、6、12和24 h时，其黏附数分别降低了11%、36%、43%和25%；与猪霍乱沙门氏菌刺激细胞0h相比，猪霍乱沙门氏菌刺激细胞3、6、12和24 h时，其黏附数分别降低了25%、40%、50%和17%；与鼠伤寒沙门氏菌刺激细胞0h相比，鼠伤寒沙门氏菌刺激细胞3、6、12和24 h时，其黏附数分别降低了35%、47%、55％和16%；并且3种致病菌均以作用细胞12h时其黏附数降低为最多。试验数据表明，丁酸梭菌能够有效抑制3种致病菌黏附IPEC-J2，其抑制效果由强到弱依次是鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌。

    从健康断奶仔猪粪便中成功分离到一株丁酸梭菌，该分离株能够显著抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌的生长，能够黏附IPEC-J2且能抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌的黏附。

文章节选自《中国畜牧兽医》2020，v.47(01):274-282.

作者：王倩，李海花，窦彩霞，等.一株丁酸梭菌的分离鉴定及其益生特性研究[J].

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